香树脂醇具有抗炎等功效,从植物中提取难度大、产率低。通过在酵母菌中表达外源香树脂醇合酶基因N,可高效生产香树脂醇。回答下列问题。(含图)
(1)可从________中查询基因N的编码序列,设计特定引物。如图1所示,a链为转录模板链,为保证基因N与质粒pYL正确连接,需在引物1和引物2的5'端分别引入________和________限制酶识别序列。PCR扩增基因N,特异性酶切后,利用________连接DNA片段,构建重组质粒,大小约9.5kb(kb为千碱基对),假设构建重组质粒前后,质粒pYL对应部分大小基本不变。
(2)进一步筛选构建的质粒,以1-4号菌株中提取的质粒为模板,使用引物1和引物2进行PCR扩增,电泳PCR产物,结果如图2。在第5组的PCR反应中,使用无菌水代替实验组的模板DN
(3)为提高香树脂醇合酶催化效率,将编码第240位脯氨酸或第243位苯丙氨酸的碱基序列替换为编码丙氨酸的碱基序列,丙氨酸的密码子有GCA等。a是诱变第240位脯氨酸编码序列的引物(GCA为诱变序列),
a:5'-…GCA/CCC/GAG/TTC/TGG/CTG/TTT/CCC/TCT/TTC/TTC…-3'
b:5'-…GAA/CTG/TGG/GAC/ACC/CTG/AAC/TAC/TTC/TCT/GAG…-3'
c:5'-…GCC/TGG/CTG/TTT/CCC/TCT/TTC/TTC/CCC/TAC/CAC…-3'
d:5'-…GAT/AAT/AAG/ATC/CGA/GAG/AAG/GCC/ATG/CGA/AAG…-3'
(4)进一步检测转基因酵母菌发酵得到的________含量并进行比较,可以选出最优的香树脂醇合酶基因的改造方案。